云南普洱茶物质基础和后发酵关键技术获新进展
后发酵茶是茶叶的一大类型,因具有独特的风味和生理功能,日益受到欢迎。其中,以云南特产的大叶茶为原料,经特殊后发酵工艺生产的普洱熟茶更是驰名中外。昆明植物所张颖君研究员研究组的多位科研人员,多年来以云南普洱熟茶为研究对象,应用生物技术和天然产物化学相结合的综合技术手段与方法,在国内外首次系统研究后发酵茶的特殊风味成分的物质基础及其形成规律。在对普洱熟茶特殊风味成分化学研究的基础上,开发相关的分析方法,为普洱熟茶品质综合评价体系的建立提供了技术基础。同时首次从分子水平上揭示微生物在普洱茶后发酵过程中的作用及其机理,为普洱熟茶的规范化生产提供理论依据和技术基础。还通过系统的菌物学研究,从后发酵优势菌群中选育优良菌株,为用现代发酵工程技术生产普洱熟茶提供基础。
普洱茶是通过微生物的发酵过程而形成。在微生物的作用下,茶叶中的香气成分、茶多酚等化学物质发生结构转化,形成了一系列新的化合物,这些物质是构成普洱熟茶特殊风味和生理活性的重要物质基础。科研人员采用液相色谱和气相色谱技术,对普洱茶主要化学成分进行了定量分析。分离鉴定了一系列天然化合物,建立了普洱茶主要化学成分的定量分析技术,对普洱生茶和普洱熟茶进行了系统的化学成分比较研究。研究发现青毛茶中的主要特征化学成分,如多酚类、香气成分以及茶氨酸等,在后发酵的普洱熟茶中均发生了显著的改变,儿茶素单聚体类的含量在普洱熟茶中大幅减少,多聚体显著增加。由茶多酚分解的没食子酸成为普洱熟茶的特征性成分。从普洱熟茶中还发现了一系列新型的化合物,如儿茶素类与有机酸结合的新型内酯,具有脂肪族侧链的黄酮类化合物,以及嘌呤类生物碱(咖啡因等)与核苷结合的特殊成分等。这些特征性的化学物质是构成普洱熟茶风味的重要物质基础之一。研究还发现,普洱生茶的香气成分以芳樟醇、a-松油醇、香叶醇等单萜醇类为主,普洱熟茶则以芳香族和酯类化合物为主。中国茶叶品牌网cyppw.com
普洱熟茶的后发酵生产,实际上就是利用微生物生命活动产生的酶对茶叶原料中的化学物质进行酶转化的过程,微生物在普洱茶制作中起着极为重要的作用。目前,普洱熟茶的人工后发酵生产基本上均采用传统的渥堆方式,依靠环境微生物自然感染进行,受季节和环境条件的影响很大,参与发酵的微生物种类不明、杂菌多、发酵过程不稳定,难以控制与规范,导致产品质量不稳定,难以实现规范化生产。科研人员对云南省不同产地的普洱茶后发酵加工生产中的微生物进行了较系统的比较研究,从大量的菌群中分离纯化得到优势菌株,经菌物学鉴定主要为曲霉属真菌,包括温特曲霉烟色变种、帚状曲霉、臭曲霉、日本曲霉原变种等。其中,臭曲霉和日本曲霉原变种作为优势菌种,始终存在于不同地区和不同发酵阶段的普洱茶中。研究表明这些微生物对普洱茶的后发酵生产和风味的形成具有重要的作用,普洱茶的后发酵需要在曲霉属真菌的参与下才能进行。科研人员在传统渥堆后发酵方法的基础上,通过接种专用优势菌剂进行普洱茶的后发酵生产,不仅可抑制杂菌和有害菌群的生长,使生产过程不受季节、环境条件等外界因素的影响,而且能缩短发酵时间,提高效率,保证产品质量的稳定性,提升普洱茶加工技术,使普洱熟茶的规范化、工业化生产成为可能。通过曲霉属真菌接种,晒青毛茶的感官特征发生了显著的变化,叶色由绿色变为黑褐色,汤色由黄绿色变为红褐色,香气由绿茶的青香变为陈香,苦味变淡,涩味消失。化学成分的变化与通过自然发酵的变化相同。科研人员在对不同菌种生物学特性研究的基础上,通过菌种组合,已经研制出不同风味的普洱茶。
摘要 茶氨酸是茶叶的特征氨基酸。大量研究表明,茶氨酸的含量不仅对茶叶的品质有很大的影响,而且具有促进大脑功能和神经的生长、抗肿瘤、降压安神等功效。本文综述了近十余年来国内外在茶氨酸的形成、积累、测定、制备及应用方面的研究进展。
关键词 茶氨酸;形成;积累;测定;制备;应用
1 引言
至今为止人们在茶叶中已发现25种氨基酸。其中茶氨酸约占氨基酸总量的50%。大多数学者认为茶氨酸是茶叶的特征氨基酸,因为到目前为止除了在茶梅、山茶、油茶、簟等四种天然植物中检测出其微量存在外,其他植物中尚未发现。茶氨酸(theanine)是1950年日本学者酒户弥二郎首次从绿茶中分离并命名的,它属酰胺类化合物,化学命名:N乙基L谷氨酰胺,结构式:HOCOCHNH2CH2CH2CONHCH2CH3。自然存在的茶氨酸均为L型,纯品为白色针状结晶,熔点217~218℃(分解),比旋光度[α]20D=0 7°,极易溶于水,水解度呈微酸性,有焦糖香及类似味精的鲜爽味,研究证明它的含量与绿茶的品质密切相关,相关系数为0 787~0 876[1]。
2 茶叶中茶氨酸研究进展
作为茶叶的特征氨基酸,茶氨酸几乎存在于茶树的所有器官和组织中。经大量研究表明,茶氨酸在茶树的根部形成,然后向新梢积聚,因而茶树新梢中茶氨酸含量最高。茶氨酸的形成是茶树储存氮的手段之一,这是因为茶氨酸被茶氨酸水解酶水解为谷氨酸和乙胺,乙胺在胺氧化酶的作用下产生氨和乙醛,氨可作为氮源供茶树的幼龄组织生长,因此茶氨酸是茶树幼芽光合作用开始前有机碳骨架合成的起始物,而且也是茶树中多酚类物质的重要前体。茶氨酸在茶树中的积累与光照、温度和合成前体密切相关。研究发现当温度为25℃,黑暗条件下,在培养基中加入盐酸乙胺能明显增加茶氨酸的积累。1992年我国学者李荣林等对茶树新梢中茶氨酸的分布情况及其在不同季节、不同品种和不同栽培条件下含量的变化作了较全面的研究[2]。他们发现,随着茶树叶片成熟度的增加,茶氨酸的含量逐渐降低,因此茶氨酸可作为茶鲜叶嫩度的化学指标之一;茶氨酸在新梢中的含量随季节的不同存在显著的差异,其在春茶新梢中的含量是在夏茶中的4倍,是在秋茶中的7倍;环境对茶氨酸含量也有较大的影响,土壤的pH值下降,不利于茶氨酸的积累,而氨态氮的存在和遮荫环境有利于茶氨酸的积累; 茶叶制作过程不同,其茶中茶氨酸的含量也有明显变化。绿茶制造过程中由于谷氨酸的转化使茶氨酸的含量呈增加趋势;黄茶、青茶、黑茶制造过程中谷氨酸的变化不明显,茶氨酸呈减少趋势;白茶制造过程中茶氨酸变化的特点是长时间的萎凋中蛋白质分解,谷氨酸增多并向茶氨酸转化,因此茶氨酸开始表现为增加趋势直至干燥才有所减少;而红茶发酵过程茶氨酸变化复杂,有增有减,总趋势是减少。虽然人们普遍认为茶氨酸可作为评价绿茶质量的重要标志之一,但对红茶茶氨酸的含量与其品质的相关性问题有着不同的看法。
K.HelenEkborgOtt等在对17种茶的茶氨酸含量进行分析时发现, 某些红茶中茶氨酸的含量并不比绿茶和乌龙茶低,有的红茶 (如中国的云南茶)中茶氨酸的含量甚至还高于某些绿茶 [3]。赵和涛等在研究茶氨酸的生化特性时测定了我国六大茶类中茶氨酸的含量[4]发现以白茶中茶氨酸的含量最高,为30079mg/100g;其次是绿茶和黄茶,在17301~1944 7mg/100g之间;红茶相对绿茶低一点,为14616mg/100g;青茶为6274mg/100g;含量最低的是黑茶,只有711mg/100g,这可能是由于其加工过程中特有的渥堆作用导致了茶氨酸大量损失。因此也有学者认为茶氨酸的含量也可作为红茶品质的重要评价因子之一。湖南农业大学的唐和平等对9个茶树品种及红山茶、白山茶进行了氨基酸组成的分析[5],并比较了其中茶氨酸含量的差异,他们发现山茶中虽有茶氨酸存在,但含量甚微;通过对不同进化层次的茶树品种进行茶氨酸含量分析,证明茶氨酸含量随茶树进化层次的提高呈积累趋势,并以山茶中也发现茶氨酸说明茶与山茶存在一定的亲缘关系,由此支持茶树应属山茶属的观点。1997年齐贵年等比较了经蒸汽杀青、锅炒杀青和滚筒杀青的扁形特种绿茶氨基酸含量的变化[6],结果表明,不同工艺杀青对氨基酸组分含量有一定的影响,其氨基酸总量和茶氨酸含量均为蒸汽杀青>锅炒杀青>滚筒杀青,并且提出可通过工艺技术对茶叶中茶氨酸和其他氨基酸的含量进行调控。同年钟俊辉等研究了不同培养条件、不同碳源和不同环境对茶愈伤组织培养及其茶氨酸的积累的影响[7],发现激素IAA和6 BA结合作用时,以IAA2mg/L和6 BA4mg/L时对茶氨酸积累最有利;而培养基中碳源不同,愈伤组织的增长速率及其茶氨酸的含量的差异并不显著,但当用不同浓度的蔗糖作为碳源时发现,随着蔗糖浓度的增加茶氨酸的积累呈上升趋势。与其他文献相同,他们的研究结果表明25℃、黑暗条件有利于茶氨酸的积累。
3 茶氨酸的测定与制备茶氨酸的分析方法有多种,有传统的阴离子交换树脂层析法、薄层色谱法、气相色谱法[8,9]等。近十多年来随着高效液相色谱技术的迅猛发展,分析速度、灵敏度和自动化程度的不断提高,该技术越来越广泛地应用于氨基酸分析领域。因大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性,标准折射探测仪对氨基酸检测也无足够的灵敏度,所以为提高分析检测灵敏度和分离选择特性,通常将其衍生。二十世纪八十年代中期美国Waters公司率先推出了氨基酸自动分析系统及技术[10],他们采用异氰酸苯酯(PITC)作为衍生试剂,柱前衍生,反相色谱分离的原理,用紫外检测进行氨基酸分析。随后,惠普公司推出了HPAminoQuant氨基酸分析系统及技术[11],采用邻苯二甲醛(OPA)和氯甲酸芴甲酯(FMOC)作为衍生试剂,既可用紫外又可用荧光进行检测。董泗建等对几种柱前衍生的氨基酸分析法的色谱条件进行了改进[12],在降低成本的基础上进一步优化了分离效果。1994年Waters公司又推出了一套全新的氨基酸分析技术,他们采用6 氨基喹啉 N 羟基琥珀酰亚胺基 氨基甲酸酯(AQC)作为衍生试剂,以乙腈和水作为流动相,梯度洗脱,紫外或荧光检测器检测,该法简称为ACCQ TAG法。在日本学者莽也邦夫等采用高效液相色谱法测定了茶叶中茶氨酸含量之后,我国学者郭升平对用高效液相色谱测定茶叶中茶氨酸进行了较详细的研究[13],他采用WatersM344高效液相色谱仪,以PITC柱前衍生,反相C18柱分离(Waters的Pico TagTMHAA柱),柱温43℃,梯度洗脱,用M990二极管阵列检测器,在UV243nm检测。在研究中他对用乙酸乙酯提取、用80%乙醇回流3h提取和经盐酸水解等前处理的方法进行了比较,发现茶氨酸不能以酸水解方式提取,否则茶氨酸会分解成谷氨酸,而使测定结果偏低。随着近年来分析技术和分析手段的不断提高,毛细管电泳技术和液质联用技术也应用到了茶氨酸检测领域。KiehneA等报道了采用热喷雾液质联用仪分析茶叶中多酚类物质的方法[14],他们通过测定其准分子离子峰同时测定了茶叶中的儿茶素、黄酮醇糖甙、黄酮糖甙及咖啡因、可可碱和茶氨酸。AucampJP等则研究了用毛细管电泳仪同时进行儿茶素、茶氨酸、咖啡因及没食子酸、抗坏血酸分析的方法[15]。
目前,高纯度的茶氨酸主要通过细胞组培、化学合成、微生物发酵和离子交换树脂分离等方式获取。人们用14C示踪的方法早已证实了茶树中茶氨酸合成前体是谷氨酸和乙胺。一般认为当培养基中乙胺的浓度为25mM时,茶叶愈伤组织的茶氨酸的生物合成为最大值。1998年陈瑛等研究了多种激素对茶愈伤组织合成茶氨酸的影响[16],他们对生长素(IAA)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、2,4 二氯苯氧乙酸(2,4 D)、6 苄基腺嘌呤(6 BA)、玉米素(ZT)、激动素(KT)、和三十烷醇(TA)的不同浓度、不同配比进行试验,得出了茶愈伤组织生长和茶氨酸积累的较佳培养条件。除了利用细胞组织培养茶氨酸之外,化学合成也是得到高纯度茶氨酸的有效方法[17]。采用化学合成手段制造氨基酸始于二十世纪五十年代,它具有价格低,成本低,适合工业化生产的特点。但是化学合成制造的都是DL 型消旋体,需要进行拆分才能得到L 型产品。日本学者在这方面作了大量的工作,他们采用微生物固化酶分离DL 型氨基酸取得了成功。采用微生物发酵法可直接得到L 型氨基酸,但反应时间较长,设备规模较庞大,副产物也较多,需要进一步分离精制,成本相对较高。因此建立在化学合成法和微生物发酵法基础上的酶转化法或称酶工程技术应运而生了。这种技术是应用特定酶的催化作用,使某些化合物转化成相应的L 氨基酸。HideyukiSuzuki等报道了他们把这一技术应用到茶氨酸的制备中的最新研究成果[18],他们利用从细菌中得到的谷氨酰转肽酶作催化剂,将200mM谷氨酸和1 5M乙胺在pH为10,温度为37℃的条件下,保持2小时,获得120mM茶氨酸,转化率为60%。茶氨酸作为两性物质,选择适当的pH值,用离子交换树脂分离提取也是一种有效的手段,但这方面的报道并不多见。1998年陈瑛等报道了用离子交换法提取茶氨酸的研究结果[19],他们选用国产732阳离子交换树脂,从茶愈伤组织浸提液中提取茶氨酸,并讨论了洗脱液离子强度和pH值对树脂吸附茶氨酸的影响,以及上样浓度、洗脱速度对树脂交换过程的影响。
来源及分布:由浙江省遂昌县农业局、松阳县农业局于1973-1999年在由杭州市茶叶科学研究所引进的福鼎大白茶与云南大叶茶自然杂交后代(名为池边03号、福云0-3、波峰)中采用单株育种法育成。浙江丽水、温州、金华地区有栽培。山东和贵州部分茶区有引种。栽培面积已逾2000hm2。
特征:植株较高大,树姿直立,分枝较稀,叶片呈下垂状着生。叶长椭圆形,叶色深绿,叶面微隆起,叶缘微波,叶齿粗浅,叶尖急尖。芽叶绿色,茸毛特多,一芽三叶百芽重94.0g。
特性:芽叶生育力强。春茶萌发期为3月上旬,一芽一叶期为3月末。5龄茶树的茶园每亩平均产量达111.0kg。春茶一芽二叶干样约合氨基酸4.1%、茶多酚31.7%。适制绿茶,加工银猴、毛峰等名优茶,色泽翠绿,多毫,香高,味鲜浓,汤色、叶底翠绿明亮。抗寒性较弱。抒插成活率较高。
适栽地区:浙江绿茶茶区。
栽培要点:选择向阳低山坡土层深厚的地块种植。采用4次低位定型修剪,第一次定剪高度15-20cm。及时防治黑刺粉虱等病虫害。
八仙茶曾名汀洋大叶黄。无性系。小乔木型,大叶类,特早生种。二倍体。 来源及分布:由福建省诏安县科学技术委员会于1965-1986年从诏安县秀篆镇寨坪村群体中采用单株育种法育成。在福建、广东乌龙茶茶区有较大面积栽培。湖南、广西、四川等省区有引种。1994年全国农作物品种审定委员会审定为国家品种,编号GS13012-1994。 特征:植株较高大,树姿半开张,主干较明显,分枝较密,叶片呈稍上斜状着生。叶长椭圆形,叶色黄绿,有光泽,叶面微隆起或平,叶缘平,叶身平,叶尖渐尖,叶齿稍钝浅密,叶质较薄软。芽叶黄绿色,茸毛少,一芽三叶百芽重86.0g。花冠直径3.9cm,花瓣6瓣,子房茸毛少,花柱3裂。 特性:芽叶生育力强,发芽较密,持嫩性强。一芽三叶盛期在3月中下旬。产量高,每亩产乌龙茶200kg。春茶一芽二叶干样约合氨基酸1.7%、茶多酚26.2%、儿茶素总量20.8%、咖啡碱4.3%。适制乌龙茶、绿茶、红茶,品质优。制乌龙茶,色泽乌绿润,香气清高持久,滋味浓强甘爽;制绿茶、红茶,香高味厚,是制绿茶与工夫红茶的优质原料。抗旱性与抗寒性尚强。抒插繁殖力较强,成活率较高。 适栽地区:乌龙茶茶区和江南部分红茶、绿茶茶区。 栽培要点:挖深沟种植,增施有机肥,适当增加种植密度。压低定剪高度,增加定剪次数,促进分枝。幼龄期茶园铺草覆盖。乌龙茶要及时分批、按“小至中开面”鲜叶标准留叶采摘,不宜偏嫩或偏老采。冬季注意预防冻害。
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