提要 安吉白茶(Camellia sinensis)是具有阶段性返白现象的温敏突变体。利用SDS-PAGE电泳分析了返白和复绿过程中各阶段叶片可溶性蛋白组分，尤其是RuBP羧化酶大、小亚基的变化，并利用同位素法测定了此过程中RuBP羧化酶活性的变化。利用内源基质法测定了蛋白酶活性的变化，并分析了其变化与蛋白质源库代谢、叶绿素变化之间的相关性。发现安吉白茶在返白与复绿过程中叶片可溶性蛋白的主要变化是RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差异，这种差异与RuBP羧化酶活性的变化是相一致的。同时返白阶段蛋白酶活性较高，可溶性蛋白含量降低，是造成游离氨基酸总量明显积累的直接原因。
关键词 安吉白茶；阶段性返白；温敏突变体；蛋白酶； RuBP羧化酶
Studies on the Stage Albescent Phenomenon in Tea
——the Changes of RuBPcase and Proteinase
Li Sufang Chen Ming Yu Fulian Cheng Hao
(Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008)
Abstract The variation of large and small subunits of RuBPcase from temperature-sensitive mutant of Anjibaicha (Camellia sinensis) during its stage albescent process was investigated as well as the changes of the enzyme activities. The relationship between the levels of the RuBPcase subunits and the activities of proteinase was also discussed. It was found the levels of both large and small subunits were low at the albescent stage and became normal after leaves recovered to green, which corresponded with the enzyme activity change. Meanwhile, the high activity of protease and the lowering of leaf soluble protein content. At the albescent stage were the direct reasons for the accumulation of free amino acids.
Key words Anjibaicha；Stage albescent mutation；Temperature sensitive mutant；Proteinase； RuBPcase
我们业已报道了温敏叶色突变体安吉白茶在返白过程中伴随着叶片色素含量的可逆性变化，其茶多酚含量、氨基酸含量与组成等都有对应的相关变化〔1，2〕，尤其是返白阶段的氨基酸总量比对照品种高出许多，使以此突变体为原料制作的成品茶滋味较为鲜爽；不仅如此，在返白与复绿过程中还有叶绿体数量分布和叶绿体超微结构〔3〕的可逆性变化。但以安吉白茶无性系群体所产的种子进行繁殖的有性后代在白化性状上出现了分离，大多数种子后代不再具有返白特征，只有少量种子苗能保持其返白现象。本文主要探讨了在安吉白茶返白与复绿过程中，叶片RuBP羧化酶和蛋白酶的变化情况。
1 材料与方法
1.1 试验材料
种植在杭州中国农业科学院茶叶研究所苗圃和浙江省安吉县林科所白茶基地的无性系安吉白茶茶苗。并采用种植于本所苗圃的安吉白茶部分实生绿苗作为可溶性蛋白组分分析的对照材料。
1.2 试验方法
1.2.1 叶片可溶性蛋白组分分析
1.2.1.1 叶片可溶性蛋白提取 白茶和对照样各500mg，液氮冻干。加3.5ml可溶性蛋白提取液(30mmol／L Tris-HCl，pH 8.7；1mmol／L DTT；1mmol／L EDTA；5mmol／L MgCl2)、0.1g水不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及少量石英砂，冰浴研磨。4℃，8640r／min离心10min。取200μl，加1ml冷丙酮（内含10mmol／L巯基乙醇），摇匀后置于-20℃冰箱1h，用TGL-16离心机10000r／min离心5 min，收集沉淀，减压干燥，-20℃保存备用。
1.2.1.2 可溶性蛋白SDS-PAGE凝胶电泳〔8〕 浓缩胶浓度3%，分离胶浓度12%，含0.1%SDS。电泳后，凝胶用0.25%考马斯亮蓝R250、50%甲醇、10%乙酸固定染色6h，然后用7%乙酸和15%甲醇脱色。胶片用岛津CS-930薄层扫描仪595nm波长扫描。分子量测定用低分子量标准蛋白含兔磷酸化酶B(97400 u)、牛血清白蛋白(66200 u)、兔肌动蛋白(43000 u)、牛碳酸酐酶(31000 u)，胰蛋白酶抑制剂(20100 u)和鸡蛋清溶菌酶(14400 u)。
1.2.1.3 可溶性蛋白含量、蛋白酶活性与游离氨基酸测定 可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝染料结合法〔6〕，在岛津UV-265分光光度计上测吸光值，并计算蛋白浓度。蛋白酶活性测定采用内源基质法〔7〕。游离氨基酸含量测定用国标法GB8312-87。
1.2.2 RuBP羧化酶提取及酶活力测定
1.2.2.1 RuBP羧化酶提取〔4,9〕 鲜叶去叶脉，液氮冷冻24h，再保存于-30℃冰柜待用。取10g上述保存的材料，加入80ml预冷的新鲜提取液（50mmol／L磷酸缓冲液，pH7.4，内含1mmol／L EDTA，5mmol／L巯基乙醇，10%甘油)，及2g水不溶性PVP，预冷的组织捣碎机匀浆，快速5s，慢速5s，重复3次。然后经4层预冷纱布过滤，滤液经11900r／min离心20min，收集上清。
1.2.2.2 RuBP羧化酶活力测定 采用同位素方法测定。总体积为800μl的反应混合液含100μmol Tris-HCl缓冲液(pH7.8)，10μmol MgCl2，8μmol NaH14CO2 (2μCi)，2μmol DTT和100μl上述提取的RuBPcase酶液。25℃预温10min使酶活化，加入0.5μmol RuBP使反应开始。5min后，加入800μl HCl终止反应,90℃烘箱干燥。PACKARD 1900CA双道液体闪烁计数器测定，按以下公式计算酶活力：
U=DPM×3.997×60×V／(2.22×106×5×10-1)(CO2μmol.g-1.h-1FW)
式中：3.997为每微居里(μCi)14C相当于CO2的微摩尔数(μmol)；60为分钟数(min)；V为每克鲜重植物得到的酶液原液的体积(ml)；2.22×106为每分钟内1μCi14C的蜕变数；5为反应时间(min)；10-1为反应体积中酶液的体积(ml)。
2 结果与分析
2.1 叶片可溶性蛋白的电泳分析
叶片可溶性蛋白组分测定材料为本所苗圃3年生茶苗，自4月9日起每隔一周取样至5月16日叶片复绿时止。各时期样品电泳后进行比较，未能发现有明显的组分变化，仅发现有两条带的强度在不同时期有显著差异。将电泳胶片在薄层扫描仪上扫描后，其结果(图1)证实这两条带的含量在白化期与复绿后差异较大。根椐与低分子量标准蛋白质的对比计算，确定它们的分子量分别为54.2ku和14.9ku左右。经与菠菜RuBP羧化酶提纯品的多次比较，确认其为RuBP羧化酶大、小亚基。由图1可见，白茶突变体RuBP羧化酶大、小亚基含量在白化初期与全白期均处于较低水平，复绿后急剧升高，两个亚基的变化幅度基本相近。
因为安吉白茶突变体原发现于安吉山区一农家茶园，已无法找到产生这一突变体的原茶树种群来作为对照，为确证这种RuBP羧化酶大、小亚基含量的变化确实是与突变体的返白性状有关，而不是叶片本身发育的原因，选择了安吉白茶突变体的种子后代中不表现返白特性的植株作为对照，对比了突变体与其有性后代在各时期RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差别。种子后代叶片可溶性蛋白电泳胶片的扫描结果如图2所示。根椐电泳图谱的对比，也未能发现白茶突变体与其有性后代在叶片可溶性蛋白组分上有明显差异，但作为对照的突变体有性后代RuBP羧化酶两亚基在各时期的水平基本没有变化，与白茶复绿期水平接近，大大高于白茶返白期水平。该结果与对照植株不表现白化突变的现象一致，说明白茶RuBP羧化酶亚基的含量变化确实是由突变引起的。
EA：返白初期；FA：全白期；HG：复绿中期；FG：全复绿期；LS：RuBP羧化酶的大亚基；SS：RuBP羧化酶的小亚基
EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage；LS: The large subunit of RuBPcase; SS: The small subunit of RuBPcase
图 1 安吉白茶突变体返白过程不同阶段叶片可溶性蛋白SDS-PAGE电泳结果扫描图
Fig.1 SDS-PAGE scanning profiles of soluble leaf proteins during Anjibaicha albescent progress
EA：相当于白茶返白初期； FA：相当于白茶全白时期；FG：相当于白茶全复绿时期；LS：RuBP羧化酶的大亚基；SS：RuBP羧化酶的小亚基
EA: The same time to early albescent stage; FA: The same time to fully albescent stage;FG: The same time to fully green stage；LS: The large subunit of RuBPcase; SS: The small subunit of RuBPcase
图 2 安吉白茶有性后代不同阶段叶片可溶性蛋白SDS-PAGE电泳结果扫描图
Fig.2 SDS-PAGE scanning profiles of the soluble leaf proteins of Anjibaicha seedling progenies
2.2 返白过程中RuBP羧化酶的活性变化
为进一步确证RuBP羧化酶在返白与复绿过程中的变化，采用同位素方法测定了白茶突变体返白过程各时期RuBP羧化酶的活性。其结果(图3)表明该酶活性在返白初期即较低，随叶片返白程度的加深又略有下降，然后又随叶片的逐步复绿而渐渐升高，其变化趋势与返白过程中叶绿素的变化完全一致。这一结果不仅与叶片可溶性蛋白的电泳结果一致，也和已观察到的返白复绿过程中叶绿体结构的解体与恢复现象〔3〕一致，说明安吉白茶在返白期叶绿体的结构与功能同时受到了严重的破坏，而在复绿期又得到了重建。
EA：返白初期；FA：全白期；SG：复绿初期； HG：复绿中期；FG：全复绿期
EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; SG: Slightly green stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage
图 3 安吉白茶不同返白复绿阶段RuBP羧化酶活性的变化
Fig.3 Variation of RuBPcase activity at the different albescent stages of Anjibaicha
2.3 返白过程中蛋白酶的变化
RuBP羧化酶大、小亚基含量的同时下降提示我们需对蛋白的降解作一分析，为此测定了白茶突变体返白与复绿各阶段蛋白水解酶的活性、可溶性蛋白含量和游离氨基酸总量。其结果(图4)表明，与随后的复绿阶段相比，返白期蛋白水解酶活性总体较高，可溶性蛋白含量较低，两者有较好的负相关性；而总游离氨基酸明显积累，其峰值与蛋白水解酶活性最大值几乎同时出现。而复绿后蛋白水解酶活性逐步降低；与此对应，可溶性蛋白含量随复绿过程逐步升高，同时游离氨基酸含量下降，游离氨基酸库容的变化与可溶性蛋白含量变化呈较好的负相关性。因此安吉白茶在返白阶段游离氨基酸库容的增大，很可能是由于蛋白酶活性的增大，导致了蛋白质的大量水解引起。
EA：返白初期；FA：全白期；HG：半复绿期；FG：全复绿期
EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage
图 4 安吉白茶不同返白复绿阶段可溶性蛋白,游离氨基酸和蛋白酶活性变化
Fig.4 Variation of proteinase activity, soluble protein level and free amino acid content at the different albescent stage of Anjibaicha
3 讨论
RuBP羧化酶是一种重要的叶蛋白，几乎占叶片可溶性蛋白的50%左右，催化光合作用中CO2的固定。安吉白茶在返白与复绿过程中叶片可溶性蛋白的主要变化是RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差异，这种差异与RuBP羧化酶活性的变化是相一致的，与返白过程中蛋白酶活性的变化呈负相关关系。许多学者认为，RuBP羧化酶是植物蛋白酶水解的最佳底物，因此造成RuBP羧化酶大、小亚基含量在白化期下降的原因，很可能是由于突变诱发的蛋白酶活性升高导致了RuBP羧化酶蛋白的大量水解。因此，蛋白酶活性在白化期的显著上升是安吉白茶白化期氨基酸总量增加的直接原因。
高等植物的RuBP羧化酶是一个由核基因和质体基因共同编码的基因产物，其大亚基的合成由叶绿体基因组中单一基因编码，而小亚基的合成则由核基因组中的多基因编码。在水稻中，由叶绿体基因组缺失所导致的花培白化苗，其RuBP羧化酶大亚基水平极低而小亚基较为正常〔5〕，而核基因突变产生的水稻白绿苗〔5〕，则两个亚基同时受到影响。安吉白茶在其返白与复绿过程中，RuBP羧化酶大、小亚基含量基本上同时下降与上升，与水稻白绿苗的情形较为类似。且其种子后代中只有少量种子苗能够保持返白特征，因此安吉白茶的返白突变不可能是仅仅由于质体基因组突变产生。
*国家自然科学基金与浙江省自然科学基金资助项目。
精选阅读
李荣林方辉遂
(浙江农业大学茶学系310029)
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Abstract
The investigation on polyphenol oxidase intea sphere has been startedsince the blackteafermentation.Yhe tea fermentation was historicalyconsidered as the action of microorganisms.Afterthen,it was gradually revealledthatthefermentation is the function of the internalenzymes in tea.Finally,it was confirmed thatthis process is mainly completed by polyphenoloxidase.Owing to its special position in tea processing,polyphenol oxidase .Owing to its opecial position in tea processing,polyphenol oxidase has been uninterruptedly studied in teasphere since the end of 18 century and theresearch ckntent has been greatly enlarged anddeepened.This paper tried to summarixe theresearch achievements on tea polyphenol oxidase in past one century
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四、80年代以来的进展
80年代以来对茶叶多酚氧化酶的研究依然兴趣不减，1980年前苏联学者Лруцлзе ГН在早期探索的基础上进一步提出萎凋时PPO分子形态可能发生了变化，PPO可以有高分子态和低分子态两种，萎凋时多酚酶可能发生低分子态向高分子态转化，使总酶活提高［３１，７
３］。1981年UllahMA提出萎凋时酶活因失水而下降，用适当的方法复水可使酶活得到一定程度恢复58，59］，1986年萧伟祥指出，近期的研究中关于萎凋时PPO活性变化趋势出现了两种完全相反的结论，他认为这是酶提取方法不同所致。丙酮粉法测出的是总酶活，而匀桨法测出的是可溶性的活性。萎凋时可溶性酶活性下降，而总酶活上升［53］。1988年刘仲华研究表明，用丙酮粉法提取酶浸提与不浸提相比酶活有很大不同，浸提12小时酶提取液活力几乎提高一倍［65,66］。实际上早先Roberts已经观察到类似结果［16］。1986年萧伟祥对红茶中残留酶作了详细研究，发现PPO在成品茶中仍有一定活性(31，32)。1981年DixMA用葡萄糖凝胶测定了POD和PPO的分子量，以蓝色糊精等进行校正，01NKCl柠檬酸洗脱，PPO在12Vc有一弱肩峰，分子量142000，另一峰在139Vc，分子量71000，证明PPO具有高分子态和低分子态两种状态。以后有人用高速离心法测定出PPO分子量，如以U(偏微分比容)07-078计算，PPO分子在128000-160000之间，即144000±160000［31］。80年代以来多酚氧化酶同工酶研究受到进一步重视。茶的多酚氧化酶同工酶研究始于60年代中期，1965-1966年竹尾用淀粉凝胶把PPO分成3个组分［45］，1966年Ｇｒｅｇｏｒｙ用Ｇ１５０也得到3条同工酶。1981年刘维华用聚丙烯酰胺凝胶电泳［62］，1983年安徽农学院茶叶系用圆盘电泳［31］分别从萎凋叶中获得了5条同工酶。1988年叶庆生研究发现萎凋中总酶活下降，而且所得6条同工酶活性也呈下降趋势(65)。1988年胡振长研究了杀青过程中多酚氧化酶同工酶的变化，发现杀青后仍存在1-2条同工酶［67］，1989年刘仲华研究了红茶制造过程中多酚氧化酶同工酶的动态，证实萎凋中有新的同工酶产生［65］。
1990年施兆鹏研究了黑茶制造过程中多酚氧化酶的变化，结果表明杀青后同工酶由6条减为2条，至渥堆开始时这两条同工酶也消失，渥堆12小时有新的同工酶出现，作者认为这是微生物分泌出多酚氧化酶的结果［69］。
1988年屠幼英测定了多酚氧化酶同工酶的等电点［70］，1991年又测定了各同工酶分子量74］。1990年谭振初［71］,刘仲华［69］各自独立地证明柠檬酸可促使多酚氧化酶活化。稍早一些时候Ｔｏｃｋｌａｉ试验站Ｃｈｏｕｇｈｕｒｒｙ Ｍ．提出果胶质和果胶酶能抑制PPO活性(51)。
1990年屠幼英、吴小崇证实萎凋时可溶性PPO活性下降，而PPO总酶活性上升，但这种变化与失水无关，萎凋中确有新的同工酶出现，已糖激酶能够促进萎凋叶多酚氧化酶活性的提高而抑制鲜叶多酚氧化酶的活性［72］。1991年屠幼英总结了PPO抑制剂的类型，有硼砂、酚类、亚硫酸钠、Vc、半胱胺酸、二乙基二硫代硫酸钠等［70］。80年代以来多酚氧化酶同工酶在茶树育种和生理上的应用取得显著进展。前苏联学者曾提出PPO活力和PPO酶蛋白含量可作为发酵力的指标［76］，我国学者龚景文、陈兴琰(1988)研究了若干茶树品种POD、PPO以及酯酶同工酶的差异，认为同工酶可作为品种分类的依据［77］。浙江农业大学茶学系(1988)建立了同工酶数据处理方法（76）。黄惠华(1991)研究了PPO的等电点，发现叶与花的同工酶等电点基本无异，可以视为遗传特征［76］。
1983年鸟屋尾忠之等人研究了PPO与茶树遗传的关系，认为PPO至少受两组基因的控制，作者估算了PPO广义遗传力和狭义遗传力的大小［79］。
1987年杨跃华研究了同工酶变化与茶抗逆的关系，认为逆境下茶树各酶系统包括PPO都有新的同工酶产生［79］，唐继平(1987)［81］，StephenSN/(1990)［88］研究了杂交后代PPO遗传的关系，指出PPO主要受优势亲本的左右。
1992年SinghHP研究了花器中多酚氧化酶的变异，结果表明整个花期中PPO在花器中的分布及同工酶特征都保持稳定，因此花器中PPO的特征可作为选种的依据［89］。
1993年王利琴用圆盘电泳分析了PPO同工酶与遗传的关系［82］。新近奚彪等提出用基因工程方法改变茶树体内PPO存在状态的设想［95］。
虽然已可以肯定红茶的变色过程中微生物不起主要作用，但微的可能作用仍不应忽视。
1973年富金原考由绿茶分离出两种产PPO菌株，枝孢霉(Ａｌｔｅｒｎａｒｌｌａ Ｔｅｎｎｉｓ)和链孢霉（Ｃｌａｄｏｓｐｏｓｉｕｍ Ｃ．）［８７］，苏联学者也分离到两株高产菌：Ｍａｃｅｉｌｉａｉｒ，Ｃｏｒｉｏｕｌｏｕｓ Ｈｉｒｓｕｔｕ［83，86］
。1987年加藤和冈本顺子研究了微生物PPO用于茶发酵的可行性［84］
。1992年印度学者从茶树叶片中分离出具有较高PPO的活性的7株真菌和3株细菌，并认为细菌更有前途［95］。1990年施兆鹏在研究黑茶渥堆中的PPO活性变化时也曾推测微生物在渥堆叶中分泌了多酚氧化酶［69］，所有这些研究为微生物在茶叶制造中的作用提供了新见解。
1983年李名君［86］，1985年Ｊｅｎｉｓｈ Ｃ［90］分别对茶叶中已知的酶系作了全面综述，1988年曾洪涛、刘仲华、李远志、张堂恒各自从不同角度讨论了茶叶加工中多酚氧化酶的应用问题［84，85，86］，刘乾刚对多酚氧化酶定位问题作了总结［94］。1992年Obenda从植物生理角度讨论了茶的多酚氧化酶ＣａｔｃｈｏｌＯｘｄｓｓｅ区别于Tｙｒｏｓｉｎａｄｅ(酪氨酸氧化酶)，Ｌａｃｃａｓｅ(漆酶)的独特性质［89］。1993年曾晓雄，1996年李荣林对茶叶加工中酶的利用现状和前景作了展望，侧重介绍了单宁酶和多酚氧化酶研究和利用中存在的问题［93，95］。
在茶叶加工中单宁酶的应用早已成功，并已应用了固定化酶，受此启发1981年ＰｒａｂｈａＴ．研究了芒果和茶叶多酚氧化酶的固定化［90］。1992年前苏联学者Ｃｈｉｎｄｉｌｉｓ Ａ．研究了多酚氧化酶酶电极的制作技术及酶电极法测定儿茶素的方法［91］。中国和日本学者也开展了相应研究［95］。一般认为茶的多酚氧化酶是一种邻二酚氧化酶，但已有证据表明茶叶的氧化酶提取物确有单酚氧化酶和三元酚氧化酶的活性，可以催化对香豆酸和焦酚的氧化。这表明茶多酚氧化酶是一个复杂的体系［95］。
一个世纪以来茶多酚氧化酶研究的进展是巨大的，但仍有众多的问题需要解决，特别是PPO的生理功能——末端氧化酶的真正地位问题至今仍缺乏明析的概念。与此相关的问题是多酚氧化酶的底物——茶多酚类物质的生理功能的研究仍相当贫乏。此外有关该酶的分子结构的研究
耿马蒸酶茶是云南省临沧市耿马县的特产。蒸酶茶具有外形条索紧直，茶叶汤色碧绿，清澈明亮、滋味清香回甘，经久耐泡，内含物质丰富，消暑解渴、美容、益寿、助消化、防衰老、抗辐射、实为茶叶中之珍品。
云南耿马蒸酶茶（集团）有限公司生产的“回味牌”蒸酶茶系列产品，是采用耿马得天独厚的生态条件，以云南大叶种优质有机茶为原料，采用先进独特的工艺技术精制而成，该产品具有外形圆晖紧结，茶晶微霜显露，汤色鲜绿明亮，滋味鲜香可口，具有玉米香型、板栗香型、清香型等多种香气成分，饮用后令人回味不已等特点，而且含有多种有益人体健康的营养物质。其产品主要品种有银针茶、银钩茶、露珠茶、蒸酶茶、碎绿茶、勐撒蒸绿茶，名优茶有青山碧剑、绿海雪芽、勐撒翠螺、毛峰茶、月之芽茶。
“回味牌”蒸酶茶系列产品，自开发投产问市以来，一直深受广大消费者欢迎，曾被云南消费者协会评为“消费者最喜爱产品“称号，从而成为云南名牌产品，并先后多次获得国际国内举办的各种博览会金奖，同时被联合国技术信息促进系统中国国家分部评为“优秀民营企业”称号，2003年7月荣获“全国质量服务消费者满意企业”称号和“全国质量信得过产品”称号，2003年10月我公司使用的《.回味牌》注册商标，荣获首届“云南省著名商标”称号，并得到重点保护。其产品主要销往省内昆明、丽江、楚雄、曲靖、大理、昭通等地，国内销往上海、辽宁、福建、安徽、河南、广东、贵州、四川、重庆等城市，国外销往日本、缅甸待国，部分作为馈赠补品送往泰国、美国、新加坡、马来西亚和港澳台地区。
休眠是茶树对不良环境条件的一种适应方式。当外界条件对生长适宜的时候，茶树能够迅速地开展旺盛的生长活动，完成一年的生长与发育过程；当环境条件对生长不利时，茶树生长活动逐渐停止，代谢活性降低，以度过不良生态条件。因此，休眠是茶树在长期的进化过程中所形成的一种特性，并且已经在遗传性中固定下来。茶树通常利用芽的休止或休眠，度过不利的生态环境。 导致茶树休眠的因素很多，如温度的高低，日照的长短，水分和养分的多少，甚至光质和光量的不同，都能引起树体休眠。茶芽休眠有两种：一种是新梢轮次之间的“自然休眠”，持续数天或几周，然后自行解除，开始下一轮次的生长；另一种是“被迫休眠”，由于外界日照、温度条件等不能满足茶芽生长的要求所致，持续时间长短不一。在自然界中，冬季严寒到来之前的信号是日照时间缩短，这一信号比低温更为可靠而准确。通常当冬季的白天至少有6周短于11小时15分钟这个临界值时，茶树就要通过一个完全的休眠期。这个黑暗的时间愈长，休眠期也愈长。从杭州地区茶树新梢生育进程观察到，这个临界值正处于霜降时节（10月下旬），白天日照时数为11小时13分钟。因此，茶树冬季休眠主要是由于短的白昼（或长的黑夜）影响树体内部生长调节剂的结果。秋季的低温和短日照是抑制茶芽生育的原因，也是从生育过渡到休眠的条件。在赤道，整年的日照时间都超过12小时，因此热带和近热带地区的茶树终年不出现休眠现象，仅受雨量的影响，茶芽生长有快慢之分，或因树体内部的原因，茶芽呈明显的间隙生长。随着纬度增加，休眠的时间不断递增。我国不同地域茶树休眠期，有如下差异：江北茶区的胶东半岛，茶树休眠起讫时期为10月上旬至翌年4月中旬，休眠期达6个半月；在江南茶区的杭州，茶树休眠起讫时期为10月下旬至翌年3月中旬，休眠期达5个月；在华南茶区的海南省，茶树终年无休眠期。
生茶正确工艺，在杀青这一环节，强调高温快速杀熟杀透。
那这样以后酶的活性还存在吗？后期靠什么来转化？
这是影响了很多制茶人的一个误区。
这个误区的完整版是：
晒青毛茶在杀青时，温度不能过高。杀青过程中没被杀死的酶，仍有活性对普洱茶的后发酵很重要。温度过高会把酶杀死，不利于后期存放。
实际上，如果按上述做法做，短期内茶涩味会退得快，但从长久来看，茶汤会越变越淡。
要解决这个问题，关键在于，理解普洱茶的越陈越香是什么？以及它是如何发生的？
1.陈化路径
广义来讲，茶叶在存放过程当中，品质一定会变化，或是茶汤刺激性减弱，或是香气由高扬变沉稳等等。这些变化背后，主要是两种陈化路径的的参与：
氧化
氧化能够改变茶叶里很多物质的性状，尤其是儿茶素类的氧化，会使口感变得柔和，但过度氧化会使茶汤汤质发散，趋于无味。
微生物转化
茶叶里的糖苷类物质会滋养一些微生物，微生物进而将茶叶的纤维裂解开，产生溶于水的多糖类，同时使原本捆绑在纤维链中的蛋白质脱离出来，产生游离氨基酸。
2.什么是越陈越香
氧化会使茶叶口感变得柔和，过程中香气可能转趋复杂，但最终汤质会发散，趋于无味。
根据每个人的审美喜好不同，可以主观认为这种变化是好的，特别是中途某些时段香气会变得复杂，很多人因此认为茶陈放之后品质提升了，这也是某种越陈越香。
但这么一来，越陈越香便可以通用于所有茶叶了，甚至不单是茶叶。
因此，我们需要为接下来所讨论的越陈越香下个定义：在陈放过程中，汤质越变越厚，喉韵越变越深、体感越变越强。
认可以上语境，我们可以继续往下推演。
3.越陈越香的机理
微生物消耗存储在茶叶中的简单能量物质（主要是以糖苷形式存储的葡萄糖），进一步活动，分解叶底中的纤维，产生出更多溶于水的多糖类，于是汤质变厚。
同时，纤维链中原本被束缚的蛋白质脱离出来，进一步分解出游离氨基酸，于是喉韵变深。
整个过程中溶于水的总能量物质增多，于是体感变强。
糖苷类很重要，它能够缓释滋养微生物。微生物才是普洱茶越陈越香的关键。
正是微生物转化的作用，使得茶汤变得越来越厚，喉韵越来越深。
4.杀青、酶与糖苷类物质
保留糖苷类的关键，是及时杀死活性酶，减少酶促分解。
如果杀青不透，导致活性酶（尤其是糖苷酶）有一定量的残余，活性物质（尤其是糖苷类物质）会继续氧化分解，短期会显得香甜突出，但是不能长时间滋养微生物。
长远来看，茶叶缺乏微生物转化，茶汤会越来越散，厚度会越来越低。
如何做到正确的杀青？
杀青的目的是利用高温让酶失活。酶是蛋白质，达到85℃时，3分钟内蛋白质即变性了，如果只达到80℃，时间就需要延长到十分钟左右。
如果温度再低，便需要继续延长（但糖苷类就分解过多）；当温度低于60℃，基本就炒不熟了（氧化路径会增强，茶叶变淡）。
理想的杀青是尽可能短时间，尽可能高的温度，在不炒糊的前提下杀熟杀透。
小小茶叶片，包藏天地之间的时令之气。时令即四季和当令之气。中草药有“五运六气”，茶属中药一族，也有“五运六气”，故善养生者以茶为药，拾遗补缺，促进天人和合。
时令茗茶从春天发芽到霜降前，按不同节气采茶，用茶截取时令变化的偏性，以茶之偏性纠人身心之偏，使之平衡。
绿茶
绿茶绿茶是原汁原味的茶。如果说花茶是梳妆打扮，香气沁人的美丽新娘，红茶是饱经磨练，温馨高雅的贵妇，那绿茶就是天真青春的少女。
从制作工艺上讲，绿茶是最早的茶类。古人采集茶树叶芽晾干收藏，从广义上看是一种茶的制作。这种方法从神农发现茶能解毒就开始了。现代使用的制茶方法，包括杀青、揉捻、干燥三道程序。
杀青是绿茶生产的关键环节。绿茶的漂亮颜色，乃至绿茶的内涵特质，取决于杀青成功与否。揉捻是对杀青茶塑形的一道工序。揉捻分为冷揉和热揉。时间一般在20～25分钟。传统的茶制作干燥法，是在揉捻过程中，把塑形和干燥合二为一。在烧热的锅里，茶工用手旋转、揉捻、按压、抖动茶叶，直到茶叶成型、干燥。一个茶工每次炒500克。
红茶
红茶红茶是全发酵的茶。因冲泡之后汤为红色，故称红茶。茶性凉。但有些品种在性凉的范畴内偏温，红茶即是其中一类。这与红茶的制作方法有关。红茶的制作包括：萎凋、揉捻、发酵、干燥四道程序。
萎凋是让鲜叶阳气内敛。由刚强易折碎转为柔软耐捻。叶片失去鲜亮光泽，青草气消失，颜色变暗绿柔情，透出能沁人肺腑的清香。
揉捻以破青叶率90%左右为佳。用手紧握汁溢而不滴流为宜。
发酵是让茶叶氧化。红茶经氧化后，90%的茶多酚转化为茶黄素一类物质。凡是经发酵的食物均可产生大量的酶，酶有利于消化。清黄宫绣《本草求真》记载：白面、杏仁、赤小豆、青蒿、苍耳、红蓼六味药碾碎加水揉团发酵，待表面长出黄色菌丝时，切成小块晾干。此药名“六神曲”，有健胃和脾，清积热，消食调中之功能。
茶叶发酵后转为“酶茶”，从养生学角度有三个特点。
凉性减弱。茶发酵后凉性衰减。发酵室温在24～25℃，相对湿度95%。发酵过程中青草味消失，叶色变红，散出清新的花果香味。茶的凉性得以改善。
酶助消化。青茶发酵有助消化。发酵时间长短根据茶采摘节气和特质决定，发酵火候是关键。优质红茶既有醇厚的香气，又有较强的助消化能力。红茶酶与其他的含酶制品不同，除了酶化功能外，还有分解、除垢、清秽气特点。如果人的肠胃嘈杂，似饥不饥，似痛不痛等等，饮一杯热红茶，可解嘈杂。这是红茶酶化和去秽气二者合一的功劳。
时令气息酶化。带有时令气息的茶通过酶化，化瘀去浊的妙用更强烈。时令红茶按节气分开采摘。不同年运和节气采摘的茶叶，发酵后不仅色泽有区别，养生效果也不同。如春红茶养肝，夏红茶养心，秋红茶养肺入肾。
发酵成功的茶要及时高温干燥，确保茶的质量。干燥要迅速固定茶叶发酵的状态，不让其发酵继续;蒸发茶中水分，缩小体积，使其处于干燥状态，以利保存;散发各类杂气，留下红茶纯正的香味。
花茶
花茶从现有资料看，明朝前就已有花茶。医药学家李时珍的《本草纲目》记载：“茉莉可熏茶。”花茶的大规模生产在清朝咸丰年间。北京城是茉莉花茶购销兴旺的地区之一。
制作花茶主要利用茶善吸收异味的特点，把花与茶混合，使茶吸收花香后，筛出残花，即得花茶。上等花茶没有残花，只有浓郁的花香。
茶工经过长期实践创造出许多制作花茶的方法。可谓各有绝活。花茶的香料以茉莉花为主，也用玉兰花等;也有用香蕉苹果气味熏茶的。花朵在夜里一定的时辰吐香最浓，利用这一特点，使茶吸取香气尤为重要。上等花茶要用不同的花反复薰多次，使得花茶的气味浓厚不艳，清新凝重。香味是植物的可挥发物质，有较强的渗透性。当人闻到花茶香味时心旷神怡，是“芳香化浊”的缘故。即香味进入肺，与氧一起进入血液，增强了细胞的兴奋。
花茶除花薰之外，揉捻和干燥等工序与绿茶的制作有许多相同之处。
花茶比照红茶和绿茶有一定神秘性。花茶的魂在“花”。花香是可收集为“精油”的气体，这种气体有较强的“侵入性”和“控制力”，当茶和花香混合时，这种气体便控制了茶叶。
随着环境条件的周期性变化，茶树每年都有一个年发育周期，进行萌芽发枝、开花结实等生命活动，这又称为茶树的年变化。
1地下部分与地上部分的活动
在年周期内，茶树根系的活动不仅受气候、土壤等环境条件的影响，而且与树体内养分积累的多少有关。在不同的时期内，地下部分的生长势有强有弱，生长量有多有少。但根系的生长总是与地上部分新梢的生长交错进行。当地上部分生长旺盛时期，则是地下部分生长缓慢时期；当地上部分生长缓慢时期，则是地下部分生长旺盛时期。一年内，茶树地下部分（根系）适应地上部分的活动，可以出现三个生长高峰，时间分别是3—4月、5—6月和9—10月，其中9—10月的生长高峰比前两个生长高峰都大，持续时间也更长。掌握茶树的这一生长规律，可以在茶树根系生长高峰期内正确进行中耕、除草、施肥等农业技术措施，以达到最大的效果。
2新梢的生长与休眠
通常日平均气温达到10益以上，几天后茶芽就开始萌动生长，逐步长成新梢。其生长顺序是：芽体膨胀寅鳞片开展寅鱼叶（奶叶）开展寅真叶开展寅驻芽形成。
我国多数茶区新梢的生育期为6—8个月。如果新梢不经采摘，则驻芽经过短期休止后，继续生长。这样能重复生长2—3次。如果经过采摘，小桩顶端留下的1—2个腋芽，又可以各自萌发成新梢。这样在栽培条件下，每年可萌发4—6次。茶树新梢多次萌发的特点，对茶叶生产有重要意义。每次萌发情况略有差异：由于春季雨水充沛，加上茶树在越冬期积累了大量的养分，因而一旦气温适宜，春梢很快就开始生长，而且萌发较为整齐、旺盛；夏秋季气温偏高，茶树体内的养分相对不足，加上旱季受温湿条件的限制，这些都不利于新梢的正常生长；入冬以后，新梢的生长受到低温的限制，进入休眠。
3叶片的生长与脱落
叶片由叶原基发育而成，其生长成熟的时间各不相同（春梢较长，夏梢较短），大约需要20天左右。在生长过程中，叶片有3次明显的伸展活动：先由内折到反卷，再由反卷到平展，最后定型。
叶片的寿命也不相同，一般为期一年，很少能达到两年。其中春梢的寿命最长，夏、秋梢的较短。由于气候变化和耕作技术的影响，有些叶片往往不到一年便已脱落。每年5—7月是茶树的落叶盛期，6月为最高峰。所以在落叶前期采摘时，应该保留一定的新叶，以满足茶树正常生长的需要。
4,开花与结果
入夏以后，腋芽分化发育成花。一般春梢孕育的花芽，营养较为丰富，开花较早，坐果率较高；而夏梢孕育的花芽，数量通常最多，却营养不足，坐果率不高；秋梢孕育的花芽，则大多不能结果。
从花芽分化至种子成熟，前后历时15—16个月。因此，在一个年周期的6—11月，同一茶树上既可以看到当年的花、蕾，又能够看到上年的果实。这就是茶树的“带子怀胎冶现象，其在热带地区表现尤为突出，是茶树的一种重要特征。
栽培茶树的目的，是为了采摘茶叶，而不是为了采收茶果。然而花果在生殖发育期间会抑制茶树的营养生长，因此茶农多采取一系列的农业技术措施，加强茶树的营养生长，抑制花果的形成，以达到茶叶丰收的目的。
茶树品种的茶类适制性是指茶树品种固有的制约着茶叶品质的种性，也就是指茶树品种最适宜制作哪一类或几类优质茶的特性，简称适制性，可以通过芽叶的物理特性观察和化学特性测定进行间接评估，这在茶树品种选育的早期尤其常用。
物理特性是指茶树新梢上芽叶的肥瘦、大小、叶色、叶质、叶片厚薄、柔软程度、嫩度、茸毛等的特征和状态，它与成品茶的外形品质息息相关。叶片小、叶张厚、叶质柔软、细嫩、色泽显绿、茸毛多的品种，宜制显毫类的绿茶；芽叶纤细、叶色黄绿或浅绿、茸毛少或中偏少的品种，宜制少毫型的龙井类扁形绿茶；叶片大、节间长、芽头肥壮、芽叶黄绿色、茸毛多、叶面隆起、叶质软、叶张薄的品种，宜制红茶。
化学特性是指芽叶中化学成分的含量和组成，它是形成茶叶色香味的物质基础。化学特性的测定一般按一芽三叶标准采集鲜叶，在100℃温度下蒸3分钟，80℃温度下烘干制蒸青茶样品，然后将样品磨碎进行化学成分测定。尽管茶树品种的化学特性受种植地区环境及栽培条件的影响较大，但同等条件下不同品种间的化学特性差异仍然明显。一般茶多酚含量高，且茶多酚与氨基酸的比值（简称酚氨比）大的品种，制红茶品质优；而氨基酸含量高，茶多酚含量适宜(16%～24%)，且酚氨比小的品种，制绿茶品质优。
在生产中，茶树品种的适制性一般通过同一品种的鲜叶制作不同类别的茶叶，进行感官审评直接鉴定，采取评分与评语相结合的方法。先称取茶样倒入审评杯内，再冲人沸水，．浸泡5分钟开始审评。茶叶的品质分别按外形、汤色、香气、滋味、叶底逐项以百分制评分，并以相应的评语描述，最后再按外形、汤色、香气、滋味及叶底的品质权数计算总分。分数的高低便能直接反映出品种品质的优劣，即一个品种对某一茶类适制性的大小，而相应的评语则可以描绘出不同品种的制茶品质特点。
不同茶类的品质要求不一样，而每一品种固有的适制性又制约着茶叶的品质，加之不同品种间的适制性差异较大，适制绿茶的品种不一定适制红茶，适制显毫类绿茶的品种不适宜制作少毫型绿茶。茶树品种的适制性是生产上用种重点考虑的指标之一，只有选择适制性对路的茶树品种，才能生产出相应优质的茶类产品。
我国茶树品种中适制绿茶品种有：特早芽种有元宵绿；早芽种有福鼎大白茶、福鼎大毫茶、九龙大白茶、福云595等品种。适制乌龙茶品种：早芽种有黄旦、茗科一号、丹桂等品种；中芽种有铁观音、佛手、白芽奇兰等品种，迟芽种有肉桂、本山等品种。绿乌兼制品种有：黄旦、黄奇、梅占等品种。
（一）蛋白质
茶叶中蛋白质主要有白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等，其含量一般占茶鲜叶干重的20%左右。茶树中蛋白质一般情况下较难溶于水，所以蛋白质营养对饮茶的意义不大。但在利用茶叶作食品添加物和作动物饲料等情况下，茶叶中蛋白质养分可以得到充分利用。
（二）氨基酸
氨基酸较易溶于水，所以氨基酸对茶汤品质和生理药理作用较大。茶叶中已被发现并鉴定的氨基酸有26种。氨基酸与人体健康关系密切。谷氨酸、精氨酸能降低血氨，治疗肝昏迷；蛋氨酸能调节脂肪代谢，参与机体内物质的甲基运转过程，防止动物实验性营养缺乏所导致的肝坏死；胱氨酸有促进毛发生长与防止早衰的功效；半胱氨酸能抗辐射性损伤，参与机体的氧化还原过程，调节脂肪代谢，防止动物实验性肝坏死；精氨酸、苏氨酸、组氨酸对促进人体生长发育以及智力发育有效，又可增加钙与铁的吸收，预防老年性骨质疏松。与茶叶保健功效关系最密切的氨基酸是茶氨酸和γ-氨基丁酸。现作简要介绍。
1.茶氨酸 茶叶中所有游离氨基酸，茶氨酸的含量占1/2左右。
大量研究表明，茶氨酸具有很好的医疗保健功效。目前已证实茶氨酸具有以下几方面的功效：促进神经生长和提高大脑功能，从而增进记忆力和学习功能，并对帕金森氏症、老年痴呆症及传导神经功能紊乱等疾病有预防作用；防癌抗癌作用；降压安神，能明显抑制由咖啡碱引起的神经系统兴奋，因而可改善睡眠；具有增加肠道有益菌群和减少血浆胆固醇的作用；还有保护人体肝脏、增强人体免疫功能、改善肾功能、延缓衰老等功效。
2.γ-氨基丁酸 γ-氨基丁酸也是一种非蛋白质氨基酸，茶叶中γ-氨基丁酸的含量一般在0.2～2微摩／克。
γ-氨基丁酸对人体具有多种生理功能，可作为制造功能性食品及药品的原料。研究证明，γ-氨基丁酸具有显着的降血压效果，它主要通过扩张血管维持血管正常功能，从而使血压下降，故可用于高血压的辅助治疗。它还有改善大脑血液循环、增加氧气供给、改善大脑细胞代谢的功能，有助于治疗脑中风、脑动脉硬化后遗症等。γ-氨基丁酸还有改善脑功能、增强记忆力的功效，其机制是提高葡萄糖磷脂酶的活性，从而促进大脑的能量代谢，活化脑血流，增加氧供给量，最终恢复脑细胞功能，改善神经功能。还有报道指出，y-氨基丁酸能改善视觉、降低胆固醇、调节激素分泌、解除氨毒、增进肝功能、活化肾功能、改善更年期综合征等。
茶树品种是最重要的茶叶生产资料之一。我国茶产业发展的每一步,都体现茶树良种的贡献。20世纪50年代开始有计划的无性系茶树品种选育,所育成品种的推广应用,促进了70年代至80年代茶叶产量的快速增长,对茶叶出口创汇做出了积极贡献;为了适应国内名优茶开发,20世纪90年代我国茶树育种工作者培育了大量优质、早生的茶树品种,在国际市场非常严峻的情况下为我国茶产业的可持续发展提供了保证。综观我国茶树育种目标的变化,经历了“高产-优质-早生-多抗”的发展历程。进入21世纪,茶产业开始向产品开发多样化、茶功能成分用途多样化以及市场需求多样化的方向。发展,茶树育种目标随之多样化。
分子生物学技术和基因工程技术的推广和应用是进入21世纪以来茶树育种技术发展的重要特点之一。首先,DNA遗传多样性鉴定技术如RAPD、AFLPRFLP、SSR、STS、SCAR、CAPS和EST等已经广泛应用于茶树资源遗传多样性的分析、资源分类、亲本鉴定、品种性状和真实性鉴别等领域,使这些领域的研究从形态或细胞学水平提高到分子水平,标志着茶树分子育种时代的开始。
其次,克隆并获得了大量控制茶树重要经济性状的基因或基因片段,包括茶树儿茶素类代谢相关基因,茶多酚氧化酶基因,茶叶香气物质释放相关酶基因,茶树咖啡因合成相关基因,茶树主要氨基酸合成相关基因,茶树耐酸铝相关基因,茶树白化相关基因,茶树品种抗寒、抗旱、抗虫相关基因等;对这些基因序列的解析,不但有助于我们对茶树遗传变异机理的深入理解,而且为今后有目标地改造茶树的遗传性状和创造新的遗传资源奠定了良好的基础。
由于茶产业发展状况良好,新世纪头几年是有史以来我国无性系茶树良种繁育推广最快的时期,也是茶树育种和良种繁育研究的黄金时期。为了使茶树育种更好地适应茶产业的发展,在未来研究中应该注意:
第一,要注重应用技术的自主开发。目前茶树育种领域存在一个倾向是重理论研究,轻技术自主开发。如在分子生物学技术的应用中,要针对本产业领域未来的技术需求,如与茶树重要性状密切相关的基因克隆及其应用;借助分子生物学的技术进一步明晰茶树品种品质、抗性和产量形成的原理,开发提高品质、抗性和产量的相应技术,缩短茶树育种的年限,提高育种效率。
第二,要注重高技术的储备。如转基因茶树的释放目前还有限制,对其利弊也有不同观点,但不应该成为障碍技术开发的因素。因为茶树转基因离产业化应用还有许多没有解决的问题,相关技术需要深入研究并作为技术储备。
第三,要关注育种后备队伍的培养。茶树育种是一个漫长的过程,不容易出成果,影响青年技术骨干从事该领域工作的积极性,许多育种单位面临队伍青黄不接,老一辈育种家毕生精力获得的育种材料面临荒废。第四,要注重品种权的保护。茶树无性繁殖方式是对品种保护的严重挑战,目前没有现成可以借鉴的保护措施,需要研究相应的保护措施和制度,为了保护育种者的权益和积极性。
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